Lehrplattform Histologie
 Sitemap Hilfe
Home > Allgemein > Methoden
AllgemeinDruckerfreundliche Version
Methoden

Unmittelbar nach der Entnahme setzt in Gewebeproben die Autolyse bzw. Heterolyse ein. Das Gewebe muß daher sofort frisch bearbeitet oder aber fixiert werden. Durch die Fixation wird die Zersetzung aufgehalten. Für die Aufbereitung von lichtmikroskopischen Standardpräparten durchläuft die Gewebeprobe 4 Schritte:

  1. Fixierung
  2. Einbettung
  3. Schneiden
  4. Färben


Fixierung

Das am weitesten verbreitete Fixierungsmittel ist das Formalin. Dabei handelt es sich um eine verdünnte und gepufferte Formaldehyd-Lösung. Formalin vernetzt und denaturiert Proteine und verleiht dem Gewebe eine gummiartige Konsistenz. Lipide und nicht mit Proteinen assoziierte Kohlenhydrate werden aber durch diese Routine-Methode nicht vernetzt.

Unfixiertes und fixiertes Gewebe kann durch Einfrieren gehärtet und damit schneidbar gemacht werden. Man verwendet dazu das Gefriermikrotom. Diese Methode wird angewandt, wenn Wert auf eine schnelle (z.B. intraoperative) Diagnose gelegt wird. Allerdings führt das Einfrieren und die vermehrte mechanische Beanspruchung des unfixierten Gewebes häufiger zu Artefakten. Besonders geeignet ist die Gefriermethode zur Herstellung von Schnitten, in denen Fett dargestellt werden soll. Auch enzymhistochemischen und immunhistologischen Färbungen können auf diese Art durchgeführt werden..

Hartsubstanzhaltige Gewebeteile (Knochen, Zähne) sind nicht schneidbar und beschädigen das Messer. Daher müssen vorher die Mineralsalze entfernt werden. Als Entkalkungsflüssigkeit wird z. Bsp. verdünnte. Ameisensäure oder EDTA (Komplexbildner mit Ca2++) verwendet.

Fixierung:
  1. Formalin- fixierung
  2. Gefrier- fixierung für:
  • Schnell- schnitte
  • Darstellung von Fetten
  • enzym- histochemi- sche und immuno- histochemi- sche Färbungen
Abb. 1 - Zuschneiden des formalinfixierten Präparates  Legende
  Abb. 1
Das formalinfixierte Präparat wird in kleine Stücke geschnitten

 

Einbettung
Um dünne und gleichmäßige Schnitte herstellen zu können, muß das Material Stabilität und eine gleichmäßige Konsistenz aufweisen. Dafür tränkt man das Gewebe in heißem Paraffinwachs, das bei Abkühlung erstarrt. Da Paraffin nicht wasserlöslich ist, muß das Gewebe vorab in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert werden.

Einbettung in:
  • Paraffin- wachs
  • Acryl- Kunstharz
Abb. 2 - Entwässerung des Präparates  Legende
  Abb. 2
Das Präparat wird in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Dafür wird es in den Korb (rechts oben auf dem Bild) gelegt und verweilt jeweils eine gewisse Zeit in den einzelnen Gefässen der aufsteigenden Alkoholreihe, bis das Wasser im Gewebe durch Alhohol ersetzt ist.

 

Anschließend wird der Alkohol durch ein Intermedium (z.B. Xylol) verdrängt und dann das Xylol durch heißes Paraffinwachs ersetzt. Die von Paraffin durchtränkten Gewebestücke werden dann in ein Gießschälchen gelegt, mit heißem Paraffin übergossen und zu einem Paraffinblock verabeitet, wobei die Einbettkassette (mit der Fallnummer) den Blockträger bildet. Das Gewebe wird derart angeordnet, daß die zu schneidende Fläche auf dem Boden liegt. Nach Erkalten des Paraffins wird der Block aus der Gießform herausgelöst.

 

Mehr dazu:
Für unentkalkte Hartgewebe (Zähne, Knochen) verwendet man anstelle des Paraffins Acryl-Kunstharze, die auch ohne Entkalkung die Herstellung von Schnitt- oder Feinschliffpräparaten erlauben.


 
Abb. 3 - Einbetten vom Gewebe  Legende
  Abb. 3
Das Gewebe wird mit diesem Apparat in Parafin eingebettet und erlangt so die nötige Stabilität für das anschliessenden Schneiden im Mikrotom.

 

Schneiden
Gewebeschnitte von einigen µm Dicke lassen sich nur mit Präzisionsinstrumenten (Spezialapparaturen) herstellen. Zum Anfertigen von Paraffinschnitten werden Rotations- oder Schlittenmikrotome verwendet. Diese bestehen aus einer Haltevorrichtung, in die das Blöckchen eingespannt wird, einem Messer und einer Mechanik zur Steuerung der Schnittdicke. Der Block wird bis unmittelbar unter die Schnittebene des ebenfalls fest eingeschraubten Messers gebracht. Danach beginnt man die gewünschten Schnitte von 2 bis 7 µm Dicke zu schneiden. Der Schnitt schiebt sich dabei auf das Messer. Von dort wird er mit einem angefeuchteten Pinsel abgehoben und in ein Warmwasserbad übertragen. Hierdurch wird der Schnitt gestreckt und von Falten befreit. Dann werden die Schnitte auf saubere und fettfreie Objektträger aufgezogen. Dazu werden diese so tief und schräg in das Wasserbad gehalten, daß der Schnitt an der gewünschten Stelle aufgezogen werden kann. Die Objektträger werden je nach Färbungen in Küvetten sortiert und bis zum Färben in einem 37° C warmen Brutschrank zum Trocknen und zur besseren Haftung aufbewahrt.


Abb. 4 - Das Mikrotom  Legende
  Abb. 4
Das eingebettete Gewebe wird im Mikrotom fein geschnitten für die anschliessende Färbung.

 
Färben


Nach dem Schneiden und Trocknen im Brutschrank werden die Schnitte in Xylol entparaffiniert, durch die absteigende Alkoholreihe wieder in ein wässeriges Milieu überführt und schließlich in den jeweiligen Färbelösungen gefärbt. Je nach Färbung läßt man die Schnitte sofort trocknen oder bringt sie durch die aufsteigende Alkoholreihe bis ins Xylol und deckt sie dann mittels eines Deckglases und eines Materials, das an der Luft aushärtet, ein (Eindeckung). Dies dient nicht nur der Konservierung des gefärbten Schnitts, sondern erleichtert aufgrund der speziellen Licht brechenden Eigenschaften von Deckglas und Eindeckmedium auch die mikroskopische Analyse.

1. Physikochemische Vorgänge bei Färbungen
Elektroadsorption
: Grundlage ist der amphotere Charakter des Eiweißes. Ist der pH höher als der isoelektrische Punkt, hat die Struktur saure Gruppen und neigt zur Salzbildung mit basischen Farbstoffen - und umgekehrt.

Übersicht über Färbemethoden von Geweben

Mehr dazu:
Den unterschiedlichen isoelektrischen Punkt (I.P.) von Zellkern und Plasma nutzt man für eine Endpunktfärbung (= unabhängig von der Färbedauer) aus: liegt ein basischer Farbstoff in saurer Lösung bei einem pH vor, der zwischen dem I.P. der Kerne (etwa 3,8) und dem des Plasmas (etwa 6,5) bei 4,5 eingestellt ist, so werden selektiv nur die Zellkerne gefärbt, denn nur sie haben dann noch negative Ladung.


 

2. Chemische Färbungen
Die Reaktion zwischen Farbstoff und Substrat verläuft nach den Gesetzmäßigkeiten chemischer Bindungen. Sie gewähren also einen Stoffnachweis im chemischen Sinne. Ist der fragliche Stoff nicht vorhanden, fällt die Reaktion negativ aus (z.B. Eisennachweis).

 
Abb. 5 - Färbereihe  Legende
  Abb. 5
Das Präparat wird nach dem Schneiden im Mikrotom mit Farbstoff eingefärbt. Man unterscheidet dabei die chemische von der physikalischen Färbemethode.

 

Seitenanfang


Vorherige Seite Nächste Seite